银屑病是一种免疫介导的慢性炎症性皮肤病。尽管尚未完全了解其发病机理，但是Th17细胞及其产生的细胞因子（如IL-17，IL-22和IL-23）在银屑病的发病机理中起关键作用。证据
已经证明银屑病具有一些共同特征，包括免疫反应（由于Th17细胞）和炎性细胞因子谱，以及系统性疾病，包括炎性肠病（IBD）和肥胖症。最近，研究表明，肠道菌群在宿主的稳态和免疫应答中起着至关重要的作用，特别是Th17细胞，但是肠道菌群在银屑病中的发病机理仍不清楚。为了研究肠道菌群与银屑病之间的关系，我们使用16S rDNA测序平台分析了银屑病中的菌群分布，发现Akkermansia muciniphila的丰度在银屑病患者显著减少。既往研究表明Akkermansia muciniphila在IBD和肥胖症的发病机理中具有重要作用。因此，反映健康状况的Akkermansia muciniphila可能是银屑病，IBD和肥胖症的关键节点。综上所述，我们的研究发现银屑病患者的肠道中肠道菌群的特征和功能发生了显著变化，这为了解银屑病的发病机理提供了新的视角。
 
1、引言
 
银屑病是一种免疫介导的慢性炎症性皮肤病，其特征是由表皮增生，再生成熟，真皮中的血管生成和炎症性淋巴细胞浸润引起的红斑和鳞屑，银屑病在西方国家的人口中约占2％-3％。 在中国的发病率约0.47％； 因此，在中国估计至少有600万人患有银屑病。 尽管尚不清楚确切的发病机理，但由于其基于遗传学的环境-免疫相互作用，银屑病被认为是一种复杂的疾病。
 
不仅在小鼠模型中的研究而且在人体中的临床研究都证明，白介素（IL）-23 / IL-17 / IL-22轴是银屑病中的关键信号通路。 有趣的是，银屑病易感基因如IL23A，IL23R和TYK2可以控制Th17免疫反应，Th17细胞已被表征为产生其谱系相关的细胞因子，包括IL-17，IL-22和IL-23，这是α17的亚型。 CD4 + Th细胞谱系用于宿主防御。 在产生细胞因子的Th17细胞中，众所周知IL-23及其下游信号传导关键分子STAT3是银屑病发病机理的遗传易感性领域。此外，IL-6和IL-21激活的STAT3与转录因子协同作用， RORγ可将Th17与原始T细胞区分开。
 
人体肠道系统中有超过100万亿种微生物，由1000多种细菌，酵母和寄生虫组成。 肠道菌群在稳态和宿主健康中起着至关重要的作用。 例如，双歧杆菌已被证明是对宿主健康至关重要的肠道菌群厌氧菌。 双歧杆菌的生产涉及通过类细菌从复合多糖中释放发酵寡糖，从而通过乙酸盐和乳酸盐生成短链脂肪酸。 此外，双歧杆菌发酵的低聚糖已转化为丁酸酯，这为结肠粘膜提供了关键的能量来源。 通常，众所周知，肠道菌群可能与多种疾病的发病机理有关，例如克罗恩氏病（一种炎症性肠病，IBDs）和肥胖。
 
微生物群已被证明可协调肠道中各种淋巴细胞亚群（包括Th17细胞）的发育。 与CD4 + Th细胞的其他亚群相比，Th17细胞倾向于在肠内积聚，这表明Th17细胞的发育可能受到肠道菌群的影响。 与该概念一致的是，证据表明，通过抗生素处理或在小鼠的无菌条件下，肠道中Th17细胞的数量显着减少，这表明肠道菌群在Th17细胞的发育中起着至关重要的作用。
 
越来越多的证据表明，银屑病在临床上是与其他系统性疾病（包括克罗恩病和肥胖症）有关。困扰研究人员的问题是银屑病与这些疾病之间的关系和共同特征。 鉴于肠道菌群在维持系统同源性中起关键作用，我们提出肠道菌群可能在银屑病的发展中起关键作用，并进行了基于16SrDNA的高通量测序以探讨银屑病患者的菌群状况。
 
2、材料和方法
 
2．1 样品采集
 
根据赫尔辛基宣言，在中南大学湘雅医院招募健康对照（n = 14）和寻常型银屑病患者（n = 14）。该研究得到湘雅医院伦理委员会的批准（注册号：201 311 392）。在入组时，也将没有知悉自身免疫性疾病史的任何家庭亲属也作为对照。在样本采集前后的三天内，没有参与者食用酸奶，酱菜或奶酪。没有患者被处方开抗炎药。招募的参与者包括28个人。出于分析目的，根据描述中提及的性别平衡个体将参与者（n = 28）分为银屑病和健康对照组（表S1）。该研究得到区域伦理委员会的批准。粪便样本为收集并立即储存在-80°C，整个收集过程在60分钟内完成。
 
2.2 DNA提取和16S测序
 
根据制造商的说明，使用E.Z.N.A.®凳DNA试剂盒（美国OMEGA）分离粪便样品中的DNA。 用引物515F（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）进行细菌16S rRNA的V4保守区的扩增。 跟踪反应通过在98°C下暴露3分钟，在98°C下进行45秒，55°C下进行45秒和72°C下进行30秒的30个循环，最后在72°C下扩展7分钟。 所有样品均在Illumina Miseq平台上测序。
 
2.3 数据分析
原始数据经过过滤以消除适配器污染，并降低了质量以获得清晰的读取。然后，将具有重叠的配对末端读段合并到标签中，并将标签以97％的序列相似性聚类为可操作的分类单位（OTU）。使用核糖体数据库计划（RDP）朴素贝叶斯分类器v.2.2将分类学等级分配给OTU代表序列。根据OTU的丰度，列出每个组的OTU，由VennDiagram在R（v3.1.1）中绘制一个Venn图，然后汇总通用和特定的OTU ID。根据OUT丰度信息，计算每个样本中每个OTU的相对丰度，并使用相对丰度值执行OTU的PCA。此步骤中使用的软件是R（v3.1.1）的软件包“ ade4”。最后，基于OTU和分类等级对α多样性，β多样性和不同物种的筛选进行了分析。如果两个成对的末端读数重叠，则通过FLASH（SHort读数的快速长度调节，v1.2.11）生成共有序列，详细方法如下：（i）最小重叠长度：15 bp； （ii）重叠区域的不匹配率：≤0.1。删除配对的末端读段，没有重叠。高质量的配对末端读段被组合成基于标签的重叠总共获得866889个标签，其中30960个标签平均每个样本，平均长度为252 bp； （iii）
社区模式分析：使用USEARCH软件（v7.0.1090）的脚本将标签聚集到OTU（业务分类单位）中。
 
2.3 统计分析
为了对样本组之间的显着差异进行分析（组≥2，每组≥3），我们使用统计方法获得了样本之间微生物群落的丰度差异，并采用FDR（假发现率）评估差异的显着性 。 从结果中，我们可以识别出导致两组物种组成差异的样品。 分析群体之间的显著差异，包括动植物门，纲，科，属和种。 Metastats（http://metastats.cbcb.umd.edu/）和R（v3.1.1）用于确定哪些分类组在样本组之间存在显著差异。 我们使用Benjamini-Hochberg错误发现率校正（在R的统计信息包（v3.1.1）中的函数“ p.adjust”）对获得的P值进行了调整。
 
3、结果 

3.1 健康对照与银屑病肠道微生物群落的相似性和多样性分析
 
根据16S rDNA基因扩增子，我们每个受试者平均获得超过30,000个读数。为了研究微生物组的细节，对OTU进行了97％相似性截止的OTU分析。维恩图直观地显示了多样本/组中常见/唯一OTU的数量，结果显示两组之间共有大约70％的OTU，而健康对照组和银屑病组则分别有118和135个OTU，分别如图1A所示。接下来，进行主成分分析（PCA）来评估这两组之间的微生物群落差异，我们发现健康对照组和银屑病组之间有轻微的分离（图1B）。具有算术平均值的非加权对分组方法（UPGMA）是一种基于平均链接的层次聚类方法，用于解释由β多样性产生的距离矩阵，结果表明，大多数受试者都聚在健康对照中或银屑病组（图1C），表明这两组之间存在显著差异。 Chao和Shannon指数用于估计alpha多样性。尽管两组之间没有显著差异（图1D），但与健康对照相比，患有银屑病的受试者的多样性略有下降（图1D）
 
3.2 银屑病的肠道菌群改变
 
我们分析了健康对照和银屑病人群的微生物组成。在门水平上，我们发现Verrucomicrobia和Tenericutes的丰度在银屑病患者中降低（图2A和S1A）。此外，在纲和目水平， Mollicutes and Verrucomicrobiae， Verrucomicrobiaes 和 RF39水平在银屑病患者中也减少了（图2B，C和S1B，C）。在科水平上，银屑病的疣状微生物菌科和S24-7的相对丰度降低，而Bacteroidaceae 和 Enterococcaceae科的相对丰度增加（图3A和S2A）。在属水平上，我们发现银屑病患者的Akkermansia较少，而肠球菌和拟杆菌的丰度却增加了（图3B和S2B）。据此，在种水平上，与健康对照相比，银屑病组中的Akkermansia muciniphila减少了，并且Clostridium citroniae的含量要高得多（图4A）。
 
3.3银屑病患者阿克尔克氏菌和柠檬酸梭菌临界值的ROC曲线分析
 
最后，进行接收器工作特性（ROC）曲线以确定银屑病中Akkermansia muciniphila和Clostridium citroniae的适当临界值。 如图4B所示，ROC曲线在基于Akkermansia muciniphila和Clostridium citroniae的银屑病诊断中显示中等价值。Akkermansia muciniphila的敏感性和特异性分别为71.4％和92.9％，Clostridium citroniae的敏感性和特异性分别为71.4％和78.6％（图4B）。 在这种情况下，为了区分健康对照和银屑病患者的微生物群特征，适当的临界值设定为5.47％。
 
4、讨论

在这项研究中，尽管银屑病和健康对照之间的菌群总多样性略有变化，但我们发现银屑病患者的黏液曲霉菌含量显着降低（图2D）。该细菌是革兰氏阴性细菌，位于人类和动物的肠道中，属于疣状微生物（门），疣状微生物（类），疣状微生物（类），疣状微生物科（科），阿克曼氏菌（属）和粘菌（种）。在正常情况下，Akkermansia muciniphila的种群约占成年结肠中3％-5％的肠道菌种，占粪便中总菌群的1％以上，这表明该细菌是在微生物群落中最丰富的细菌之一。最近的研究表明，黏液曲霉可以与肠细胞结合以维持细胞屏障功能，而一项饮食干预研究表明，Akkermansia muciniphila可以作为健康状况的指标。有证据表明，患有慢性炎性疾病（包括肥胖症）以及各种肠道疾病（例如克罗恩氏病）的患者，Akkermansia muciniphila的丰度大大降低。肠道上皮层形成了肠道微生物群之间交流的“接触面”肠道细胞产生多种抗微生物肽，如防御素和C型凝集素，它们在宿主免疫力和同位性中起关键作用。肠道屏障通过粘液层和宿主产生的免疫因子而增强，屏障受损与诸如克罗恩病和肥胖症等疾病有关。在小鼠模型中，增加Akkermansia muciniphila的数量可以减轻饮食引起的肥胖，并恢复肠道屏障功能障碍。
 
银屑病，IBD和肥胖是免疫介导的慢性炎性疾病，证据表明银屑病，IBD和肥胖已显示出一些常见的致病特征，包括免疫应答（Th17，Th1和Treg）和炎性细胞因子谱（例如TNF-α， IFN-γ，IL-12、17和23）。 在这项研究中，我们发现银屑病患者的Akkermansia muciniphila的丰度明显降低，这也是IBD和肥胖症患者的特征，从而为了解银屑病的发病机理提供了新的视角。
 
总之，我们的研究表明肠道菌群在银屑病（包括Akkermansia muciniphila）中的微生物群发生了变化，这为通过人类肠道微生物群了解银屑病的发病机理提供了新的见解。 尚需进行其他研究，以加深我们对肠道菌群（包括Akkermansia muciniphila）在银屑病发病机理中的作用的了解，并探索通过肠道菌群预防或干预银屑病的可能性。