肠道微生物的代谢与宿主的寿命有关。但是，由于它需要直接控制微生物的原位代谢，因此在这两个过程之间建立因果关系仍然具有挑战性。我们展示了一种光遗传学方法来控制基因表达和代谢产物产生，所述细菌来自宿主肠道中的细菌。我们对一种在光的定量控制下分泌可乐酸（CA）的大肠杆菌菌株进行了基因改造。使用这种由光遗传学控制的菌株直接在秀丽隐杆线虫肠道中诱导CA的产生，我们揭示了CA在保护肠线粒体免受应激诱导的超片段化中的局部作用。我们还证明了该菌株的寿命延长效应与绿光的强度呈正相关，表明对宿主的剂量依赖性CA有益。因此，光遗传学可以用来实现定量和时间上的控制肠道细菌的代谢，以揭示其对宿主健康和衰老的局部和全身作用。
 
引言
 
微生物组研究已经确定细菌与宿主衰老之间的相关性。 例如，使用16S rRNA和宏基因组DNA测序将特定细菌的存在或丰富与人类百岁老人联系起来。 然而，考虑到人类肠道环境的复杂性和异质性，这些方法无法阐明特定微生物物种如何促进寿命。
 
秀丽隐杆线虫的寿命短且易于测量，这些特征彻底改变了我们对衰老和长寿的分子遗传学的理解。 使用秀丽隐杆线虫的研究还提供了对细菌物种与宿主寿命之间关系的机制理解。 重要的是，最近的研究表明细菌代谢可以产生特定的产物，直接影响宿主秀丽隐杆线虫的衰老过程或调节环境线索对秀丽隐杆线虫寿命的影响。 这些发现凸显了细菌代谢在衰老过程中调节宿主生理的重要性，并激发了人们对直接控制宿主胃肠道（GI）原位细菌代谢的兴趣。
 
在最近的几项研究中，研究人员使用了基于抗生素或碳水化合物的小分子诱导剂来调节肠道细菌的基因表达。 虽然此方法可用于对肠道细菌与宿主之间的相互作用进行原位分析，但化学效应器可能会对宿主或微生物生理产生不良影响，并且会受到缓慢且控制不佳的运输和降解过程的影响，最终限制了其准确性。
 
光遗传学将光与基因工程的感光体结合在一起，从而能够无与伦比地控制生物过程。 以前，我们和其他人已经设计感光细胞调节细菌基因表达以响应特定波长的光。 这些光感受器已用于在体外培养条件下实现细菌基因表达的精确定量，时间和空间控制。 它们也已用于体外表征和控制转录调节回路和细菌代谢途径。 在这里，我们假设对细菌基因表达的光遗传学控制可能会提供一种新的方法来微调宿主胃肠道中的细菌代谢，具有较高的时间精度，并且没有不良副作用。
 
我们使用大肠杆菌和秀丽隐杆线虫相互作用模型解决这种可能性，该模型是一种光学透明的系统，在细菌代谢和宿主寿命之间具有已知的机械联系。特别地，CA是由大肠杆菌合成和分泌的胞外多糖，其可以通过调节线粒体动力学来延长宿主秀丽隐杆线虫的寿命。首先，我们在以前设计的绿光激活，红光去激活的两组分系统CcaSR的控制下，对表达荧光报告蛋白的大肠杆菌进行工程改造。然后，我们将在其胃肠道中携带这些工程化大肠杆菌的蠕虫暴露于随时间变化的绿色和红色光信号，以证明在肠道中细菌基因表达的光学激活和失活。接下来，我们对大肠杆菌菌株进行基因工程改造，使其在CcaSR的控制下生物合成CA，并利用绿光在宿主秀丽隐杆线虫的肠道中诱导该菌株产生CA。我们的实验表明，来自宿主肠道中细菌的绿光诱导的CA足以调节线粒体动力学和寿命。我们使用这种方法以可控的方式研究了CA生产对肠道细胞的局部作用及其对生物体的系统作用，这是使用以前的将纯化的CA施用给蠕虫或喂食蠕虫的方法都不可能实现的。组成型过量生产CA的大肠杆菌突变体。这项工作为将来在没有化学诱导物缺点的情况下，在高时间，空间和定量控制下进行细菌-宿主相互作用的研究铺平了道路。
 
结果
 
为了证明对肠道细菌基因表达的光遗传学控制，我们首先设计了大肠杆菌LH01菌株，其中CcaSR控制着超级文件夹绿色荧光蛋白（sfgfp）的表达，并且表达了组成性表达以促进细菌的鉴定（图1a，图1- 图增补1，增补文件1a，1b）。 在LH01中，在存在生色团藻蓝蛋白（PCB）的情况下，绿色曝光将CcaS切换到激活状态，其中磷酸化响应调节器CcaR。 然后磷酸化的CcaR激活sfgfp从PcpcG2-172输出启动子的转录。 红灯将活动的CcaS还原为非活动形式，从而停止sfgfp表达。
 
然后，我们分别在红光或绿光下在LH01的平板上从幼虫到成年阶段饲养了两组秀丽隐杆线虫（图1b）。接下来，我们洗去了外部细菌，应用了麻痹剂左旋咪唑以防止肠道内容物排出，并将蠕虫转移到琼脂垫上。最后，我们将施加的光色从红色切换为绿色（打开），或将绿色切换为红色（关闭），然后使用落射荧光显微镜对肠腔中sfGFP和mCherry荧光随时间的变化进行成像（图1c）。在逐步实验中，蠕虫肠腔中的sfGFP荧光开始低，在2小时内开始增加，并在6小时达到饱和高水平（图1d）。另一方面，在OFF实验中，sfGFP荧光开始变高，并在1-7小时之间呈指数下降（图1d）。当去除PCB生物合成操纵子（DPCB）时，这种光响应被消除（图1d），表明sfGFP荧光的变化是由于蠕虫肠道中的CcaSR光开关引起的。
 
接下来，我们使用流式细胞仪以单细胞分辨率分析这些细菌的光响应。具体来说，我们像以前一样在红色和绿色的光线下将蠕虫饲养在光感细菌上，但随后将其清洗，瘫痪，然后将它们放入微管中，然后再进行光切换（图1b）。在8小时的几个时间点上，我们将动物匀浆，收获肠内容物，分选细菌细胞，并通过流式细胞仪测量荧光。我们观察到，我们的工程菌在宿主肠道中保持完整（图1－图2），并以单峰方式对光作出响应（图1e－g）。基因表达反应的时间动态和PCB依赖性概括了显微镜检查的结果（图1－图补充3）。我们还证实，蠕虫外部的残留细菌对流式细胞仪测量没有贡献（图1－图补品4）。总之，这些显微镜和流式细胞术实验表明，我们可以利用光遗传学来快速可逆地诱导秀丽隐杆线虫肠道中大肠杆菌的基因表达。
 
接下来，我们试图利用我们的光遗传学方法来调节活宿主肠道中细菌的特定代谢产物的产生。参与同一代谢过程的细菌基因通常聚集成操纵子，并在转录水平上受到共同调控。我们利用这种协调的调节模式，选择了cps操纵子及其转录激活剂RcsA用于测试细菌代谢的光遗传学控制。大肠杆菌中的cps操纵子由19个基因组成，这些基因编码CA的生物合成和分泌所必需的酶，而过量生产CA的细菌突变体Dlon和Dhns可促进宿主秀丽隐杆线虫的寿命。为了将CA生物合成置于光遗传学控制下，我们设计了缺少基因组rcsA的大肠杆菌菌株MVK29，并在CcaSR的控制下表达rcsA的异源拷贝（图2a，补充文件1a，1b）。我们首先检查了MVK29是否可以响应绿灯并诱导CA产生和分泌。为此，我们在红光或绿光下以分批培养法培养了菌株，并定量了上清液CA水平。在红灯亮时，MVK29分泌的CA浓度低于检测限，类似于DrcsA突变体（图2b）。另一方面，绿灯诱导MVK29分泌高水平的CA，去除PCB生物合成操纵子可消除这种反应（图2b）。此外，将CcaS催化组氨酸突变为无功能的丙氨酸（H534A），或将CcaR磷酸化位点从天冬氨酸转变为无功能的天冬酰胺（D51N），从而消除了可检测的CA产生（图2b）。重要的是，随着绿光强度的增加，分泌的CA水平呈S形增加（图2c），这与CcaSR的响应一致。我们得出的结论是，我们已将CA的生产置于CcaSR的控制之下，并且我们可以使用光来调节细菌代谢产物的生物合成和分泌。
 
然后，我们使用这种方法来研究体内肠道细菌代谢物-宿主的相互作用途径。我们首先关注蠕虫肠道中与细菌直接相互作用的细胞表型，并研究了已知受CA影响的线粒体形态。 Lon是降解RcsA的ATP依赖性蛋白酶，其缺失突变体Dlon显示CA产量增加。当蠕虫在Dlon突变细菌上生长时，其蠕虫在肠道细胞中的线粒体碎片增多，类似于补充CA的蠕虫。为了确定MVK29中光诱导的CA过度生产是否能像Dlon突变体引起的CA过度生产一样有效地影响宿主，我们饲养了两种不同的转基因蠕虫菌株，它们表达线粒体定位的GFP（mito-GFP）或线粒体定位的RFP （mito-RFP）在肠中（补充文件1b），在带有MVK29的板上，并使该板暴露于红光下。对于每种蠕虫品系，我们继续将一组暴露于红光下，但又将另一组变为绿色，持续另外6个小时（未麻痹的光照，图3a）。用左旋咪唑使蠕虫麻痹后，我们立即使用共聚焦显微镜对肠细胞的线粒体形态进行成像，并将形态分为管状，中间或碎片状（图3b）。我们发现，绿光会增加饲喂MVK29的蠕虫的线粒体碎片，但不会饲喂对光没有反应的MVK29 DPCB控制菌株的蠕虫（图3c，图3-图补编1）。因此，我们的光诱导CA生物合成菌株概括了Dlon突变体或纯化的CA对宿主的作用。
 
接下来，我们着手直接从宿主肠道内的细菌中诱导CA的产生，并研究其对肠道线粒体的影响。为此，我们从板上去除了蠕虫，洗净了外部细菌，使用左旋咪唑使它们麻痹，以阻止细菌从肠道中排出，将其暴露于绿光或红光下6个小时，然后使用共聚焦显微镜对肠线粒体形态进行成像（麻痹）。曝光，图3d）。在这些条件下，板上的CA产生失活，蠕虫仅暴露于宿主肠内细菌产生的CA。出乎意料的是，我们发现左旋咪唑治疗6小时不会杀死蠕虫，但会导致肠道中的线粒体过度碎片化（图3c，e），可能是由于左旋咪唑对线粒体NADH氧化酶的抑制作用及其相关的线粒体应激。在用左旋咪唑处理少于1小时的蠕虫中未观察到这种超片段化表型。这种应激诱导的断裂类似于与衰老和年龄相关的神经退行性疾病有关的线粒体变化。有趣的是，我们发现绿色光照抑制了肠道中带有MVK29的瘫痪蠕虫中的应力诱导的超片段化（图3e，图3－图补品1）。重要的是，我们没有发现带有DPCB，CcaS（H534A），CcaR（D51N）或DrcsA突变株的蠕虫（图3e，图3-图补充1），表明这种保护作用是光诱导的肠道内CA过度生产的结果。作为使用在肌肉中表达线粒体GFP的转基因蠕虫的对照，我们还研究了在麻痹的光照条件下的肌肉线粒体形态。我们发现左旋咪唑6小时治疗会像在肠道中一样引起肌肉中的线粒体过度碎片化，但是光诱导的肠道细菌产生的CA并不能保护肌肉线粒体免于过度碎片化（图3f，图3－图补充1）。这些结果不仅表明光遗传学可以用于体内诱导肠源性大肠杆菌分泌CA，而且还揭示了CA对肠道细胞的局部保护作用。
 
最后，我们研究了光诱导CA产生的程度如何与宿主寿命延长相关。我们首先确认，暴露于绿色光下的MVK29可以诱导CA过度生产，达到与Dlon突变体相当的水平（图4a，图4-图补品1），并且Dlon和DrcsA突变体均不对光做出响应（图4a）。接下来，从第1天成年阶段开始，我们将带有MVK29的蠕虫暴露于红色或低和高绿光强度下，导致体外CA分泌达到中等或饱和水平（图2c，图4－图补品1），并衡量他们的寿命。我们发现，与红色光相比，绿色光可延长蠕虫的寿命（图4b）。此外，在高绿灯下使用寿命延长的程度强度比低强度高1.7倍（图4b，补充文件1c），表明剂量依赖性效应。同时，我们测量了携带CA过量产生Dlon突变体的蠕虫的寿命，并表明由Dlon引起的寿命延长与光照无关（图4c）。 Dlon引起的寿命延长程度与MVK29引起的寿命延长程度相当（图4b，c，补充文件1c），这与Dlon和暴露于绿色光下的MVK29诱导CA过度生产至相似水平（图4a）。此外，带有DrcsA突变体的蠕虫的寿命也与光无关，并且在红灯下与MVK29蠕虫的寿命相当（图4d，补充文件1c）。这些结果表明，光遗传学控制足以诱导细菌产生长寿化合物并改善宿主健康。与施用细菌突变体不同，细菌代谢的光遗传学控制可以剂量依赖性方式调节宿主水平的表型。
 
讨论
我们的方法在研究微生物与宿主之间的相互作用方面具有广泛的应用。例如，我们已经鉴定了大约另外十二种与CA生物合成无关的大肠杆菌基因，并且在敲除后能提高蠕虫的寿命，尽管它们的作用机理仍不清楚。通过使用光诱导它们在肠道中的表达并测量急性宿主反应（例如线粒体动力学的变化），可以进一步探索这些基因在肠道微生物与宿主之间的相互作用中的作用。在另一个例子中，已发现由枯草芽孢杆菌在生物膜形成过程中产生的群体感应肽CSF和一氧化氮可通过下调胰岛素样信号通路来延长蠕虫的寿命。我们最近已将CcaSR移植到枯草芽孢杆菌中，并证明它能够快速，精确地控制基因表达动态。我们在此报告的方法应该能够实现对枯草芽孢杆菌基因表达和代谢产物生产的光遗传学控制，以及这种重要的革兰氏阳性模型细菌如何影响寿命的原位研究。
 
多种光感受器也可以组合起来研究更复杂的微生物-宿主相互作用途径。具体来说，我们和其他人共同表达了CcaSR，且可独立控制蓝/暗和红/远红可逆光传感器，可实现对同一细菌细胞中多达三个基因表达的同时独立控制。可以在原位进行这种光遗传学多路复用，并用于研究多种细菌基因或途径的潜在协同，拮抗或其他更高阶效应。还已经开发出大量的真核生物感光体，使得能够光学控制许多细胞和神经生物学过程。细菌和真核生物感光体可以结合使用，以实现细菌和细菌的同时光学操作，同时观察它们是否相互作用或如何相互作用的途径。光遗传学还可以用于操纵肠道内特定位置的细菌和/或宿主途径，以检查位置或组织依赖性现象。
 
最后，光遗传学方法可以扩展到其他细菌或宿主。尽管大肠杆菌是革兰氏阴性细菌的重要模型，但它不是秀丽隐杆线虫的天然共生体。由于大肠杆菌不能在线虫肠道中稳定地定居，因此我们必须使蠕虫瘫痪以促进长期实验。将CcaSR或其他细菌感光体移植到天然秀丽隐杆线虫共生体或病原体中，并将其应用于研究非瘫痪宿主体内细菌共生体的生理和病理学作用，将是未来的有趣工作。此外，很可能还可以将光用于控制其他模型宿主（例如蝇，斑马鱼或哺乳动物）中的肠道细菌基因表达。红移波长和相应的光遗传学工具可能会证明对光学透明度较低的动物或较大的动物更为优越。总体而言，通过实现细菌基因表达和原位代谢的精确控制，我们相信光遗传学将大大提高我们对广泛的微生物-宿主相互作用的理解。特别是，通过帮助食物的消化，肠道细菌会改变其基因表达和代谢，从而产生特定的代谢产物，从而影响附近的其他微生物和宿主。了解动态饮食-微生物-宿主之间的相互作用需要一种定量的方法来以时间控制的方式操纵细菌基因的表达。例如，在补充特定食物来源后，打开或关闭细菌。反过来，检查宿主中的分子变化将有助于揭示复杂的饮食-微生物-宿主网络中的主要节点。鉴于其定量性质，快速且可逆的转换能力，为了适合于体内应用，光遗传学方法将为该研究领域提供一个新的工具箱，以解释机械微生物遗传因素如何参与那些饮食微生物与宿主的相互作用并促进宿主健康和疾病。