抑制转移性黑色素瘤患者程序性细胞死亡（PD）-1检查点蛋白的免疫疗法已显示10-20％的持久完全应答（CR）率。但是，大多数患者对PD-1阻滞没有反应，许多部分反应的患者最终会进展。为了克服对抗PD-1疗法的抗性，已经进行了广泛的研究。最有前途的线索之一涉及肠道菌群的调节，已被证明对免疫系统的发育和功能有着深刻的影响。虽然没有特定的细菌类群与免疫疗法有关，粪便微生物菌群移植（FMT）-将整个肠道菌群从一个宿主转移到另一个宿主-已在临床前模型中显示出令人鼓舞的结果。与从不响应抗PD-1治疗的黑素瘤患者接受FMT的小鼠相比，从响应者接受FMT的小鼠表现出增加的肿瘤内CD8 + T细胞浸润并增强了抗PD-1治疗的整体有效性。基于这些数据，我们设计了一项I期临床试验(NCT03353402)，以评估FMT对难治性转移性黑色素瘤患者重新诱导抗PD-1免疫疗法的安全性，可行性和免疫细胞的影响。
该试验包括两名FMT捐赠者，他们先前曾接受过抗PD-1单药治疗转移性黑色素瘤的治疗，并获得了至少一年的CR（表S1以及材料和方法）。如果患者被诊断为转移性黑色素瘤并且至少已接受抗PD-1治疗，则被认为是合格的FMT受试者。携带BRAF-V600E突变的受试者也必须在靶向BRAF的治疗上取得进展。作为试验方案的一部分，受试者经历了一个初始的“原生菌群消耗”阶段，在此阶段中，他们接受了口服摄取的抗生素（万古霉素和新霉素）72小时（图1A）。然后通过结肠镜检查（协议第0天）和口服大便胶囊进行FMT，然后重新诱导抗PD-1治疗（nivolumab）。六个组合的治疗周期包括每隔14天给予抗PD-1输注（标准剂量的尼伏鲁单抗）和额外的粪便胶囊（维持FMT），直到第90天为止。每位受试者在试验前、接受后和第65天均接受正电子发射断层扫描与计算机断层扫描（PET-CT）成像。。根据iRECIST标准，对治疗的反应定义为每次影像学观察到的客观肿瘤消退（7）。证明对治疗有临床益处的客观应答者和受试者在单药治疗90天后继续抗PD-1，并在6-8周的间隔内连续接受PET-CT，直到疾病进展。
相关研究包括粪便，肠道和肿瘤分析（请参阅材料和方法）。 在粪便样本上进行16S rRNA基因和宏基因组学测序，粪便样本是在自然微生物群落耗尽阶段（定义为预处理）之前一周从受试者收集的，以及在第7、31和65天收集的粪便样本上进行的。分别在治疗前和第31和70天收集肠和肿瘤活组织检查物。 使用免疫组织化学（IHC）和本体RNA测序（RNA-seq）评估组织样品中免疫细胞的浸润和活性。 如果没有特定基因在统计学上有显著差异，则使用基因本体论（GO）数据集进行基因组测试。 第65天影像学评估后，第2位接受者拒绝接受治疗后的活检，并立即撤回同意，剩下9位可用的接受者进行肠道和肿瘤组织评估。
在2018年6月至2019年3月之间招募并治疗了10名在抗PD-1治疗中已确认进展的受试者（表1和表S2）。分配给受试者的信息是从两个可用的捐赠者之一中接收FMT，在捐赠者1和捐赠者2之间交替进行。受试者的中位年龄为66岁（IQR 49-68），大多数为男性（70％），从上次使用前一剂抗PD-1到当前试验的第一剂的中位经过时间为113天（IQR 59-183）。在治疗前肿瘤活检中最常见的PD-L1表达类别为≥5％。在四个受试者中注意到了该表达类别，而三个受试者没有治疗前的PD-L1表达（表S2）。在安全性方面，唯一观察到的与FMT相关的不良事件是一名接受者在3至15天之间出现轻度腹胀。观察到轻度（1级）免疫相关的不良事件（irAE），主要是关节痛（表S3）。没有观察到中度至重度的irAE（2-4级），尽管有五名受试者在其先前的抗PD-1治疗品系中出现了这种irAE（表S4）。
三位受试者证明了对治疗的客观反应，所有受试者均来自捐赠者＃1组：＃3受试者获得了完全缓解，＃5和＃7受试者获得了部分缓解（图1B，表1和表S5 ）。所有响应者都跨越了六个月的无进展生存里程碑。 ＃3和＃5接受者均显示出其转移灶的初始增加，然后逐渐消退（图1，B和C，以及图S1）。 这种现象被称为伪进展（8），因为转移的放射学量的增加不是由肿瘤的扩散引起的；而是由于肿瘤的转移引起的。 ＃1接受者（＃1接受者组）表现出最初的混合反应，一些病灶消退，但总体疾病有所进展（图S2）。
粪便16S rRNA基因测序分析表明，所有受体的治疗后肠道菌群组成均与基线显著不同（β多样性，未加权UniFrac，p = 0.02，FDR = 0.05，图2A和图S3和S4）。来自供体＃1-组的接受者和供体＃2-组的接受者的治疗前微生物群组成之间无统计学显著差异（p = 0.36，FDR = 0.45）。但是，供体＃1组受试者的治疗后微生物群组成与供体＃2组的不同（p = 0.001，FDR = 0.003，图2A）。与1号供体相比，2号供体具有更高的微生物群落丰富度（α多样性）。因此，尽管预处理组合物中的富集度相似（p = 0.60，FDR = 0.77），但供体＃2-组的后处理组合物的富集度高于供体＃1-组（p <0.001， FDR = 0.001，图S5）。使用宏基因组测序来确定试验各组之间不同的特定分类单元和功能途径。受体治疗前后菌群组合物的总体比较（ANCOM测试）表明，治疗后组合物具有较高的免疫治疗有利的Veillonellaceae家族相对丰度，而双歧杆菌的相对丰度较低，据报道双歧杆菌可通过T调节细胞促进免疫耐受（图S6和S7） ）。两位捐助者以前都有可报告的免疫治疗有利特征（图S8和表S6），例如扁毛蝶科（两个捐助者）威荣菌科（捐助者＃1）和芸香球菌（捐助者＃2）的相对丰度很高（图S8）（2-4） ）。比较指定的供体的后处理受试者微生物群组成，结果表明供体＃1组的特征是较高的分类单元的相对丰富度，如Bifidobacterium adolescentis（图2B），而供体＃2组具有较高的分类单元的相对丰富度，如Ruminococcus. bromii（表S7）-以前都被描述为对免疫疗法有利的。三名反应患者（受试者＃3、5和7）的预处理菌群组成与其余人群的预处理菌群组成没有差异。将响应者的后处理成分与捐赠者＃1组的其他两个非响应者的后处理成分（接受对象＃1和＃9）进行比较时，四个分类单元在统计学上有显著差异。（图S9A）。响应者的肠球菌和南方链球菌的相对丰度较高，而非典型维隆氏菌的相对丰度较低。但是，当在整个患者队列中评估这些特定分类单元的丰度时（图S9B），会有一些无反应者，甚至是具有相似动态的预处理样品。因此，在这些分类群和对治疗的临床反应之间没有明确的关联。功能性代谢数据基于MetaCyc数据库中基因的注释（未进行代谢物水平的直接测量）。功能性代谢数据表明，供体＃1组上调了乳糖和半乳糖降解I途径（logFC = 1，FDR = 0.015），而供体＃2组上调了甲醛同化II（logFC = 2.2，FDR = 3.93e-6），甲醛氧化I（logFC = 2.4，FDR = 0.001）和肌酸酐降解I（log FC = 1.4，FDR = 0.014）途径。在两个供体组的微生物群之间显著不同的元基因组学GO基因组在图2C中进行了说明（表S8）。捐助者＃1组（＃1和＃9）中有反应的接受者患者＃3，＃5和＃7与其他两名无反应者的治疗后微生物群组成的比较显示无明显功能或代谢差异。
对所有可用的FMT接受者患者的肠样本分析表明，基因组的治疗后上调与抗原呈递细胞（APC）通过主要组织相容性复合体（MHC）I类呈递肽和IL-1介导的肽呈递有关信令（表S9分别为FDR = 0.014和FDR = 0.038）。每个供体组的分析表明，供体1组的受体上调了与APC活性，先天免疫和白介素12相关的其他基因集（表S10）。相反，供体＃2组接受者并未上调任何免疫相关基因集（表S11）。每位患者的分析表明，代表APC的CD68 +细胞的固有层浸润增加，从治疗前的总中位值353细胞/ mm2增加到569细胞/ mm2。 CD68 +的浸润集中在上皮下区域，该区域与肠腔的接近程度最高。除接受者＃6（接受者＃2组，无反应者）外，所有可用的接受者均增加了治疗后CD68+的浸润。值得注意的是，肠道样品分析并未显示出固有层中T细胞浸润的统计学显着增加（图S11），也与T细胞无关基因集富集。
对所有可用受体的肿瘤样本分析表明，多种免疫相关基因集在治疗后上调（图3D和表S12），例如干扰素-γ介导的信号通路（FDR = 1.65e-13），T细胞活化（FDR = 3.27e-12），MHC II类蛋白复合物（FDR = 9.31e-13），树突状细胞分化（FDR = 5.15e-9）和T辅助1型免疫应答（FDR = 1.06e-6）。尽管这些免疫相关基因集在仅供体＃1组的分析中富集（表S13），但在供体＃2组的肿瘤样本中，没有免疫相关基因集在统计学上显著富集（表S14）。每位患者的分析表明，五名患者（＃1，＃3，＃4，＃7和＃10）的治疗后肿瘤内CD8 + T细胞浸润增加，从治疗前89细胞/ mm2到治疗后为282细胞/ mm2。 ＃5受试者获得了接近病理的完全缓解，因为治疗后的活瘤组织占整个活检组织的<1％，而＃3和＃7受试者则获得了部分病理应答。对与肿瘤内免疫活性相关的常用研究基因的评估表明，受试者＃1，＃3，＃5和＃7的治疗后肿瘤上调了与效应子相关的基因，并具有一些相互的疲惫反应。（图3H）。但是，受试者＃10上调了与疲劳相关的基因，而没有效应子的反应。
这项研究表明，在难治性转移性黑色素瘤患者中，CR供体的FMT与抗PD-1治疗的重新诱导相结合是安全，可行的，且可能有效。 FMT被认为是常见的治疗方法，用于复发性难辨梭状芽胞杆菌的治疗研究（10），即使在免疫功能低下的患者中也证明了其安全性（11）。尽管如此，在当前的研究中，经反复FMT治疗的具有免疫功能的转移性患者中缺乏与FMT相关的并发症，且令人放心。有趣的是，FMT和重新诱导抗PD-1治疗的结合似乎是安全的，并且还导致了一些客观的临床反应。在十名抗PD-1难治性接受者中，三名表现出临床反应，包括一名CR。一项在难治性黑色素瘤患者中进行FMT和抗PD-1重新诱导的类似试验报告了前三例患者中一项客观的部分缓解和一种疾病稳定的初步结果。由于接受FMT的患者尚未接受过首次治疗，因此这些临床结局可能是由于对先前抗PD-1治疗的反应延迟所致。但是，这种可能性不大，如Ribas等人所述，报道指出，继续进行抗PD-1治疗（超过RECIST确认的疾病进展）的转移性黑色素瘤患者的延迟反应率<8％。同样，Betof Warner等据报道，用抗PD-1单一疗法重新诱导的转移性黑色素瘤患者的缓解率为5/34（<15％）（14）。这些结果可能是高估了，因为该报告中有3/5的应答者之前或之后的再用药时间至少为12个月（14）。如此长的时间段可能使免疫治疗敏感的肿瘤克隆重新出现。在我们的研究中，整个队列的中前至再诱导剂量时间仅为113天，而三个应答者中为119天。此外，我们试验的纳入标准是基于iRECIST的先前抗PD-1品系的疾病进展。根据RECIST 1.1，在随访之前，部分或全部反应可能被认为“未经证实”，但进行性疾病的分类始终被认为是最终的（15）。但是，免疫疗法有时可能会导致假进展（8），如受试者＃3和＃5所示。 iRECIST旨在区分未确诊和已确诊的疾病进展（7）（表S5）。因此，在以前的出版物中使用iRECIST可能会导致更低的故障后响应率。
相关免疫学数据可以解释这种高于预期的临床反应率。肿瘤浸润DC在将T细胞转运到肿瘤中起着至关重要的作用（16、17）。小鼠模型研究的多份报告表明，微生物群调节促进DCs向远端肿瘤的浸润，从而通过白介素12（4，18）和细胞毒性CD8 + T细胞（19-21）激活T-helper 1细胞。我们的人类FMT试验也证明了相同的发现。由于捐赠者的微生物群已移植到接受者的肠道中，因此可以假设免疫激活级联始于肠道。实际上，供体＃1组接受者显示出治疗后肠道浸润和APC活性增加。 Geva-Zatorsky等评估了不同共生肠道微生物对定植的免疫反应，并证明了微生物在肠道中的局部作用是主要是先天免疫细胞（22），随后可能迁移到淋巴系统（23）。值得注意的是，供体＃2组的受者也增加了治疗后肠道APC的浸润，尽管作为一个组，其RNA-seq结果在统计学上不显著。总体而言，增加了治疗后肿瘤内CD8 + T细胞浸润的受体也增加了APC肠道浸润。由于Chen等人的研究，CD8 + T细胞浸润的增加不太可能仅由于抗PD-1的给药。我们使用治疗前和治疗中的肿瘤活检来证明接受抗PD-1治疗的无反应患者并未增加其肿瘤内CD8 +浸润（24）。但是，微生物群驱动的肠道APC激活不一定会产生增强的肿瘤内CD8 +活性。肿瘤细胞自身内抗原呈递机制受损是众所周知的抗PD-1抗性机制，通常会导致肿瘤内CD8 + T细胞浸润不足。确实，第9位受试者的肿瘤证明了这种抗原呈递受损（图。S13）。此外，即使存在高的肿瘤内CD8 + T细胞浸润有时也无法转化为临床反应。如果T细胞浸润无效，则CD8 + T细胞浸润度高的肿瘤可能是难治性的，例如由于暴露于其他免疫检查点后CD8 + T细胞耗尽而导致的（26）。受试者＃10过度表达了这些分子，例如IDO-1（图3H）。 ＃1受试者显示肿瘤内CD8 + T细胞活性增强，在某些转移中有最初的消退，但最终因未知原因而进展。不同患者的这些肿瘤特征强调了对免疫疗法的临床反应的广泛背景，并且有益的微生物群组成不是治疗反应的唯一因素。
两个供体和来自两个供体组的治疗后受试者的微生物群组成的特征是较高的分类单元相对丰富度，而先前相对于免疫疗法的抑制转移性黑色素瘤患者程序性细胞死亡（PD）-1检查点蛋白的免疫疗法已显示10-20％的持久完全应答（CR）率。但是，大多数患者对PD-1阻滞没有反应，许多部分反应的患者最终会进展。为了克服对抗PD-1疗法的抗性，已经进行了广泛的研究。最有前途的线索之一涉及肠道菌群的调节，已被证明对免疫系统的发育和功能有着深刻的影响。虽然没有特定的细菌类群与免疫疗法有关，粪便微生物菌群移植（FMT）-将整个肠道菌群从一个宿主转移到另一个宿主-已在临床前模型中显示出令人鼓舞的结果。与从不响应抗PD-1治疗的黑素瘤患者接受FMT的小鼠相比，从响应者接受FMT的小鼠表现出增加的肿瘤内CD8 + T细胞浸润并增强了抗PD-1治疗的整体有效性。基于这些数据，我们设计了一项I期临床试验(NCT03353402)，以评估FMT对难治性转移性黑色素瘤患者重新诱导抗PD-1免疫疗法的安全性，可行性和免疫细胞的影响。
该试验包括两名FMT捐赠者，他们先前曾接受过抗PD-1单药治疗转移性黑色素瘤的治疗，并获得了至少一年的CR（表S1以及材料和方法）。如果患者被诊断为转移性黑色素瘤并且至少已接受抗PD-1治疗，则被认为是合格的FMT受试者。携带BRAF-V600E突变的受试者也必须在靶向BRAF的治疗上取得进展。作为试验方案的一部分，受试者经历了一个初始的“原生菌群消耗”阶段，在此阶段中，他们接受了口服摄取的抗生素（万古霉素和新霉素）72小时（图1A）。然后通过结肠镜检查（协议第0天）和口服大便胶囊进行FMT，然后重新诱导抗PD-1治疗（nivolumab）。六个组合的治疗周期包括每隔14天给予抗PD-1输注（标准剂量的尼伏鲁单抗）和额外的粪便胶囊（维持FMT），直到第90天为止。每位受试者在试验前、接受后和第65天均接受正电子发射断层扫描与计算机断层扫描（PET-CT）成像。。根据iRECIST标准，对治疗的反应定义为每次影像学观察到的客观肿瘤消退（7）。证明对治疗有临床益处的客观应答者和受试者在单药治疗90天后继续抗PD-1，并在6-8周的间隔内连续接受PET-CT，直到疾病进展。
相关研究包括粪便，肠道和肿瘤分析（请参阅材料和方法）。 在粪便样本上进行16S rRNA基因和宏基因组学测序，粪便样本是在自然微生物群落耗尽阶段（定义为预处理）之前一周从受试者收集的，以及在第7、31和65天收集的粪便样本上进行的。分别在治疗前和第31和70天收集肠和肿瘤活组织检查物。 使用免疫组织化学（IHC）和本体RNA测序（RNA-seq）评估组织样品中免疫细胞的浸润和活性。 如果没有特定基因在统计学上有显著差异，则使用基因本体论（GO）数据集进行基因组测试。 第65天影像学评估后，第2位接受者拒绝接受治疗后的活检，并立即撤回同意，剩下9位可用的接受者进行肠道和肿瘤组织评估。
在2018年6月至2019年3月之间招募并治疗了10名在抗PD-1治疗中已确认进展的受试者（表1和表S2）。分配给受试者的信息是从两个可用的捐赠者之一中接收FMT，在捐赠者1和捐赠者2之间交替进行。受试者的中位年龄为66岁（IQR 49-68），大多数为男性（70％），从上次使用前一剂抗PD-1到当前试验的第一剂的中位经过时间为113天（IQR 59-183）。在治疗前肿瘤活检中最常见的PD-L1表达类别为≥5％。在四个受试者中注意到了该表达类别，而三个受试者没有治疗前的PD-L1表达（表S2）。在安全性方面，唯一观察到的与FMT相关的不良事件是一名接受者在3至15天之间出现轻度腹胀。观察到轻度（1级）免疫相关的不良事件（irAE），主要是关节痛（表S3）。没有观察到中度至重度的irAE（2-4级），尽管有五名受试者在其先前的抗PD-1治疗品系中出现了这种irAE（表S4）。
三位受试者证明了对治疗的客观反应，所有受试者均来自捐赠者＃1组：＃3受试者获得了完全缓解，＃5和＃7受试者获得了部分缓解（图1B，表1和表S5 ）。所有响应者都跨越了六个月的无进展生存里程碑。 ＃3和＃5接受者均显示出其转移灶的初始增加，然后逐渐消退（图1，B和C，以及图S1）。 这种现象被称为伪进展（8），因为转移的放射学量的增加不是由肿瘤的扩散引起的；而是由于肿瘤的转移引起的。 ＃1接受者（＃1接受者组）表现出最初的混合反应，一些病灶消退，但总体疾病有所进展（图S2）。
粪便16S rRNA基因测序分析表明，所有受体的治疗后肠道菌群组成均与基线显著不同（β多样性，未加权UniFrac，p = 0.02，FDR = 0.05，图2A和图S3和S4）。来自供体＃1-组的接受者和供体＃2-组的接受者的治疗前微生物群组成之间无统计学显著差异（p = 0.36，FDR = 0.45）。但是，供体＃1组受试者的治疗后微生物群组成与供体＃2组的不同（p = 0.001，FDR = 0.003，图2A）。与1号供体相比，2号供体具有更高的微生物群落丰富度（α多样性）。因此，尽管预处理组合物中的富集度相似（p = 0.60，FDR = 0.77），但供体＃2-组的后处理组合物的富集度高于供体＃1-组（p <0.001， FDR = 0.001，图S5）。使用宏基因组测序来确定试验各组之间不同的特定分类单元和功能途径。受体治疗前后菌群组合物的总体比较（ANCOM测试）表明，治疗后组合物具有较高的免疫治疗有利的Veillonellaceae家族相对丰度，而双歧杆菌的相对丰度较低，据报道双歧杆菌可通过T调节细胞促进免疫耐受（图S6和S7） ）。两位捐助者以前都有可报告的免疫治疗有利特征（图S8和表S6），例如扁毛蝶科（两个捐助者）威荣菌科（捐助者＃1）和芸香球菌（捐助者＃2）的相对丰度很高（图S8）（2-4） ）。比较指定的供体的后处理受试者微生物群组成，结果表明供体＃1组的特征是较高的分类单元的相对丰富度，如Bifidobacterium adolescentis（图2B），而供体＃2组具有较高的分类单元的相对丰富度，如Ruminococcus. bromii（表S7）-以前都被描述为对免疫疗法有利的。三名反应患者（受试者＃3、5和7）的预处理菌群组成与其余人群的预处理菌群组成没有差异。将响应者的后处理成分与捐赠者＃1组的其他两个非响应者的后处理成分（接受对象＃1和＃9）进行比较时，四个分类单元在统计学上有显著差异。（图S9A）。响应者的肠球菌和南方链球菌的相对丰度较高，而非典型维隆氏菌的相对丰度较低。但是，当在整个患者队列中评估这些特定分类单元的丰度时（图S9B），会有一些无反应者，甚至是具有相似动态的预处理样品。因此，在这些分类群和对治疗的临床反应之间没有明确的关联。功能性代谢数据基于MetaCyc数据库中基因的注释（未进行代谢物水平的直接测量）。功能性代谢数据表明，供体＃1组上调了乳糖和半乳糖降解I途径（logFC = 1，FDR = 0.015），而供体＃2组上调了甲醛同化II（logFC = 2.2，FDR = 3.93e-6），甲醛氧化I（logFC = 2.4，FDR = 0.001）和肌酸酐降解I（log FC = 1.4，FDR = 0.014）途径。在两个供体组的微生物群之间显著不同的元基因组学GO基因组在图2C中进行了说明（表S8）。捐助者＃1组（＃1和＃9）中有反应的接受者患者＃3，＃5和＃7与其他两名无反应者的治疗后微生物群组成的比较显示无明显功能或代谢差异。
对所有可用的FMT接受者患者的肠样本分析表明，基因组的治疗后上调与抗原呈递细胞（APC）通过主要组织相容性复合体（MHC）I类呈递肽和IL-1介导的肽呈递有关信令（表S9分别为FDR = 0.014和FDR = 0.038）。每个供体组的分析表明，供体1组的受体上调了与APC活性，先天免疫和白介素12相关的其他基因集（表S10）。相反，供体＃2组接受者并未上调任何免疫相关基因集（表S11）。每位患者的分析表明，代表APC的CD68 +细胞的固有层浸润增加，从治疗前的总中位值353细胞/ mm2增加到569细胞/ mm2。 CD68 +的浸润集中在上皮下区域，该区域与肠腔的接近程度最高。除接受者＃6（接受者＃2组，无反应者）外，所有可用的接受者均增加了治疗后CD68+的浸润。值得注意的是，肠道样品分析并未显示出固有层中T细胞浸润的统计学显着增加（图S11），也与T细胞无关基因集富集。
对所有可用受体的肿瘤样本分析表明，多种免疫相关基因集在治疗后上调（图3D和表S12），例如干扰素-γ介导的信号通路（FDR = 1.65e-13），T细胞活化（FDR = 3.27e-12），MHC II类蛋白复合物（FDR = 9.31e-13），树突状细胞分化（FDR = 5.15e-9）和T辅助1型免疫应答（FDR = 1.06e-6）。尽管这些免疫相关基因集在仅供体＃1组的分析中富集（表S13），但在供体＃2组的肿瘤样本中，没有免疫相关基因集在统计学上显著富集（表S14）。每位患者的分析表明，五名患者（＃1，＃3，＃4，＃7和＃10）的治疗后肿瘤内CD8 + T细胞浸润增加，从治疗前89细胞/ mm2到治疗后为282细胞/ mm2。 ＃5受试者获得了接近病理的完全缓解，因为治疗后的活瘤组织占整个活检组织的<1％，而＃3和＃7受试者则获得了部分病理应答。对与肿瘤内免疫活性相关的常用研究基因的评估表明，受试者＃1，＃3，＃5和＃7的治疗后肿瘤上调了与效应子相关的基因，并具有一些相互的疲惫反应。（图3H）。但是，受试者＃10上调了与疲劳相关的基因，而没有效应子的反应。
这项研究表明，在难治性转移性黑色素瘤患者中，CR供体的FMT与抗PD-1治疗的重新诱导相结合是安全，可行的，且可能有效。 FMT被认为是常见的治疗方法，用于复发性难辨梭状芽胞杆菌的治疗研究（10），即使在免疫功能低下的患者中也证明了其安全性（11）。尽管如此，在当前的研究中，经反复FMT治疗的具有免疫功能的转移性患者中缺乏与FMT相关的并发症，且令人放心。有趣的是，FMT和重新诱导抗PD-1治疗的结合似乎是安全的，并且还导致了一些客观的临床反应。在十名抗PD-1难治性接受者中，三名表现出临床反应，包括一名CR。一项在难治性黑色素瘤患者中进行FMT和抗PD-1重新诱导的类似试验报告了前三例患者中一项客观的部分缓解和一种疾病稳定的初步结果。由于接受FMT的患者尚未接受过首次治疗，因此这些临床结局可能是由于对先前抗PD-1治疗的反应延迟所致。但是，这种可能性不大，如Ribas等人所述，报道指出，继续进行抗PD-1治疗（超过RECIST确认的疾病进展）的转移性黑色素瘤患者的延迟反应率<8％。同样，Betof Warner等据报道，用抗PD-1单一疗法重新诱导的转移性黑色素瘤患者的缓解率为5/34（<15％）（14）。这些结果可能是高估了，因为该报告中有3/5的应答者之前或之后的再用药时间至少为12个月（14）。如此长的时间段可能使免疫治疗敏感的肿瘤克隆重新出现。在我们的研究中，整个队列的中前至再诱导剂量时间仅为113天，而三个应答者中为119天。此外，我们试验的纳入标准是基于iRECIST的先前抗PD-1品系的疾病进展。根据RECIST 1.1，在随访之前，部分或全部反应可能被认为“未经证实”，但进行性疾病的分类始终被认为是最终的（15）。但是，免疫疗法有时可能会导致假进展（8），如受试者＃3和＃5所示。 iRECIST旨在区分未确诊和已确诊的疾病进展（7）（表S5）。因此，在以前的出版物中使用iRECIST可能会导致更低的故障后响应率。
相关免疫学数据可以解释这种高于预期的临床反应率。肿瘤浸润DC在将T细胞转运到肿瘤中起着至关重要的作用（16、17）。小鼠模型研究的多份报告表明，微生物群调节促进DCs向远端肿瘤的浸润，从而通过白介素12（4，18）和细胞毒性CD8 + T细胞（19-21）激活T-helper 1细胞。我们的人类FMT试验也证明了相同的发现。由于捐赠者的微生物群已移植到接受者的肠道中，因此可以假设免疫激活级联始于肠道。实际上，供体＃1组接受者显示出治疗后肠道浸润和APC活性增加。 Geva-Zatorsky等评估了不同共生肠道微生物对定植的免疫反应，并证明了微生物在肠道中的局部作用是主要是先天免疫细胞（22），随后可能迁移到淋巴系统（23）。值得注意的是，供体＃2组的受者也增加了治疗后肠道APC的浸润，尽管作为一个组，其RNA-seq结果在统计学上不显著。总体而言，增加了治疗后肿瘤内CD8 + T细胞浸润的受体也增加了APC肠道浸润。由于Chen等人的研究，CD8 + T细胞浸润的增加不太可能仅由于抗PD-1的给药。我们使用治疗前和治疗中的肿瘤活检来证明接受抗PD-1治疗的无反应患者并未增加其肿瘤内CD8 +浸润（24）。但是，微生物群驱动的肠道APC激活不一定会产生增强的肿瘤内CD8 +活性。肿瘤细胞自身内抗原呈递机制受损是众所周知的抗PD-1抗性机制，通常会导致肿瘤内CD8 + T细胞浸润不足。确实，第9位受试者的肿瘤证明了这种抗原呈递受损（图。S13）。此外，即使存在高的肿瘤内CD8 + T细胞浸润有时也无法转化为临床反应。如果T细胞浸润无效，则CD8 + T细胞浸润度高的肿瘤可能是难治性的，例如由于暴露于其他免疫检查点后CD8 + T细胞耗尽而导致的（26）。受试者＃10过度表达了这些分子，例如IDO-1（图3H）。 ＃1受试者显示肿瘤内CD8 + T细胞活性增强，在某些转移中有最初的消退，但最终因未知原因而进展。不同患者的这些肿瘤特征强调了对免疫疗法的临床反应的广泛背景，并且有益的微生物群组成不是治疗反应的唯一因素。
两个供体和来自两个供体组的治疗后受试者的微生物群组成的特征是较高的分类单元相对丰富度，而先前相对于免疫疗法的反应是相关的。但是，这三个响应的受试者只是“捐赠者1”组的一部分。这种不和谐的原因尚不清楚。但是，这项研究具有统计学上的能力来评估安全性，并且并非旨在比较捐赠者之间的效率。供体＃2组中缺乏临床反应者并不一定意味着在较大的队列中无法观察到临床反应。此外，我们无法确定特定的“反应诱导物”微生物群特征，也反映了先前观察报告中的不一致之处。由于供体和受体的最佳微生物群组成的特征仍然难以捉摸，因此，未来微生物群调节临床试验的设计和实施必须谨慎考虑。在考虑调节包括饮食在内的肠道微生物的策略时，必须考虑许多因素。在将微生物群纳入无菌小鼠“化身”的临床前模型中的研究可能会深入了解微生物和宿主因素。尽管如此，鉴于FMT的安全性已有数十年历史，临床前模型的结果令人鼓舞和发现提示我们的治疗效果。在当前的临床试验中，不应缺乏足够的知识来检查FMT在设计良好且受监督的人体试验中的临床潜力，从而不能阻止临床机构的研究发展，对于难治性患者尤其如此，在这些患者中，FMT的风险收益比看来是有利的。
该临床试验的一个局限性在于使用抗生素作为FMT治疗前的一部分。 采用抗生素修复是因为它增强了FMT调节报道的小鼠模型中微生物组成的能力。 据报道，万古霉素-新霉素方案是人类有效的FMT前方案。 由于我们所有的接受者都接受了完全相同的FMT前治疗方案，因此我们认为抗生素的使用不会影响观察到的免疫和临床结果。 但是，在当前研究设计中不能排除这种可能性。 总之，在难治性转移性黑色素瘤患者中，CR供体的FMT和抗PD-1治疗的重新诱导是安全可行的。 在某些患者中，这种治疗增加了肿瘤内免疫活性，这转化为客观的临床反应。 这些发现支持通过调节肠道菌群来克服对免疫疗法的抵抗力的概念。
反应是相关的。但是，这三个响应的受试者只是“捐赠者1”组的一部分。这种不和谐的原因尚不清楚。但是，这项研究具有统计学上的能力来评估安全性，并且并非旨在比较捐赠者之间的效率。供体＃2组中缺乏临床反应者并不一定意味着在较大的队列中无法观察到临床反应。此外，我们无法确定特定的“反应诱导物”微生物群特征，也反映了先前观察报告中的不一致之处。由于供体和受体的最佳微生物群组成的特征仍然难以捉摸，因此，未来微生物群调节临床试验的设计和实施必须谨慎考虑。在考虑调节包括饮食在内的肠道微生物的策略时，必须考虑许多因素。在将微生物群纳入无菌小鼠“化身”的临床前模型中的研究可能会深入了解微生物和宿主因素。尽管如此，鉴于FMT的安全性已有数十年历史，临床前模型的结果令人鼓舞和发现提示我们的治疗效果。在当前的临床试验中，不应缺乏足够的知识来检查FMT在设计良好且受监督的人体试验中的临床潜力，从而不能阻止临床机构的研究发展，对于难治性患者尤其如此，在这些患者中，FMT的风险收益比看来是有利的。
该临床试验的一个局限性在于使用抗生素作为FMT治疗前的一部分。 采用抗生素修复是因为它增强了FMT调节报道的小鼠模型中微生物组成的能力。 据报道，万古霉素-新霉素方案是人类有效的FMT前方案。 由于我们所有的接受者都接受了完全相同的FMT前治疗方案，因此我们认为抗生素的使用不会影响观察到的免疫和临床结果。 但是，在当前研究设计中不能排除这种可能性。 总之，在难治性转移性黑色素瘤患者中，CR供体的FMT和抗PD-1治疗的重新诱导是安全可行的。 在某些患者中，这种治疗增加了肿瘤内免疫活性，这转化为客观的临床反应。 这些发现支持通过调节肠道菌群来克服对免疫疗法的抵抗力的概念。
